目前，神經干細胞的分離方法主要有三種：無血清培養(yǎng)基自然篩選法、流失細胞術分選法、免疫磁珠分選法。我司采用的是神經干細胞培養(yǎng)基的自然篩選法。

　　神經干細胞培養(yǎng)基自然篩選法是迄今應用，也是zui簡單和容易操作且行之有效的方法。其原理是利用特殊的培養(yǎng)基使成熟的神經細胞無法較長時間地成活，而分離篩選出能夠在該培養(yǎng)條件下存活并增殖的神經干細胞群體。首先將含神經干細胞的神經組織通過機械或酶解分散等方法制備成單細胞，然后培養(yǎng)于含有特殊營養(yǎng)添加劑和促增殖因子的不含血清的培養(yǎng)液中。非神經干細胞在這種培養(yǎng)系統(tǒng)中由于營養(yǎng)缺陷無法較長時間地存活，而神經干細胞則適應該培養(yǎng)體系并在促增殖因子作用下生長增殖。因此，經過培養(yǎng)一段時間之后，就可獲得通過這種自然篩選而增殖形成的呈神經球狀生長的神經干細胞群體。這種利用特殊培養(yǎng)基自然篩選神經干細胞方法的優(yōu)點是：簡便易行，不需要特殊的儀器設備等條件，分離效率高，神經干細胞損傷小易于成活。

　　我公司分離培養(yǎng)神經干細胞的步驟大致如下：

　?。?） 取胎腦。

　?。?） 加Trypsin/EDTA消化，用吸管吹吸使細胞均勻分散均勻。

　?。?） 離心除去Trypsin/EDTA。

　?。?） 加神經干細胞*培養(yǎng)基培養(yǎng)。

　　當神經球較大或出現細胞貼壁分化時應及時傳代。傳代經過大致為：去除培養(yǎng)液；PBS洗滌；Trypsin/EDTA消化；離心，去上清；神經干細胞*培養(yǎng)基重懸；按比例接種。神經干細胞的體外培養(yǎng)，選用合適的體外培養(yǎng)條件至關重要。目前，神經干細胞培養(yǎng)常規(guī)使用的培養(yǎng)基為DEME/F12（1:1）加上無血清營養(yǎng)添加劑B27和堿性成纖維細胞生長因子,也有應用添加劑N2或表皮生長因子等。在此培養(yǎng)體系中神經干細胞呈神經球狀生長，即增殖的細胞不貼附于培養(yǎng)器皿上，而是圓形的細胞彼此黏附在一起形成小球狀懸浮于培養(yǎng)液中生長。當采用一些方法將其分散成單細胞后，既可由單個細胞增殖成神經球，也可由數個細胞重聚集后形成小神經球結構，然后小神經球再增殖成較大的神經球。這些神經球中，外周的細胞為新增殖的細胞，生長較為旺盛，而在神經球中央，特別是直徑較大的神經球可見到有一些細胞出現凋亡或壞死，有部分可發(fā)生自主分化，表現為帶短突起的細胞。所以，當神經球長到一定大小要及時傳代。要維持神經干細胞在體外生長，在培養(yǎng)體系中需要加入絲裂原來促進其增殖，大多數采用bFGF。適當濃度的bFGF可使神經干細胞的增殖能力達到zui大，但高濃度卻會促進神經干細胞的分化。

　　神經干細胞在體外培養(yǎng)另外很重要的一點就是如何盡量讓其少分化或不分化，除了神經干細胞本身的特性決定了一部分不對稱分裂的細胞必將發(fā)生自主分化外，培養(yǎng)條件對神經干細胞的分化與否影響很大，比如在培養(yǎng)中發(fā)現，將神經干細胞球培養(yǎng)于塑料器皿，其黏附于器皿表面并發(fā)生分化的可能要比培養(yǎng)于玻璃器皿的高很多。另外，某些底物如多聚賴氨酸或多聚尿氨酸、作為細胞外基質的的層黏臉蛋白、膠原等都能在無特殊誘導劑存在的情況下，促進神經干細胞的貼壁而分化。神經干細胞在體外分化的形態(tài)表現為由圓形變成帶有明顯突起、形態(tài)各異的神經細胞，懸浮的神經球出現貼壁呈圓盤狀，形態(tài)各異的細胞向周圍呈放射狀長出并遷移，甚至全部細胞均分化平鋪于器皿上生長。培養(yǎng)液中bFGF除了對神經干細胞的分裂增殖起著關鍵的作用外，對神經干細胞分化的作用也很重要。當培養(yǎng)液中撤除bFGF時能夠導致神經干細胞的分化，但較高濃度的bFGF卻也能促進神經干細胞的分化。